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GIDM e diabete

Concentrati piastrinici di seconda generazione e cellule staminali (fibrina ricca in leucociti e piastrine): uso nei casi di ulcera diabetica con osteomielite cronica

Autore: A. Crisci - Unit of Dermosurgery Cutaneous Transplantations and Hard-to-Heal Wound, “Villa Fiorita” Private Hospital, Aversa (CE); School of Medicine, University of Salerno, Fisciano (SA), Italy; Institute for the Studies and Care of Diabetics, Abetaia, Casagiove (CE), Italy

L’ipotesi è che l’uso di fibrina ricca di leucociti e piastrine (L-PRF) nell’osteomielite da ulcera su piede diabetico consenta il recupero da questa grave patologia. In questo studio, l’obiettivo era di standardizzare l’utilizzo di L-PRF in pazienti con osteomielite per indirizzarlo alla guarigione.

Concentrati piastrinici di seconda generazione e cellule staminali (fibrina ricca in leucociti e pia

Gli autori hanno prodotto e utilizzato membrane L-PRF da sangue periferico in 3 pazienti (tutti i diabetici) con osteomielite con lesioni cutanee da almeno 6 mesi. Le membrane, insieme al liquido surnatante dopo la compressione, sono state inserite nella lesione cutanea fino all’osso dopo uno sbrigliamento chirurgico. L’evoluzione delle lesioni nel tempo è stata analizzata.

Tutti e tre i pazienti hanno avuto positività al test Probe-to-Bone, la RMN ha rilevato ispessimento cortico-periosteale e/o focolai di osteolisi della cortico-spongiosa in adiacenza dell’ulcera. Batteri Gram-positivi sono stati trovati nei nostri pazienti nel 52% dei casi. Cocchi Gram +, come S. Aureus (15,6%), S. β-emolitico (12,1%), S. Viridans (7,1%) e Bacilli Gram- come Pseudomonas (10,6%), Proteus (7,8%), Enterobacter (5,7%) sono presenti. Candida è presente nel 2,8%.

L’emocromo non mostrava alterazioni importanti.

A oggi, due dei tre pazienti presentano guarite le lesioni cutanee (un paziente da quattro anni) senza segni d’infezione, né di recidive (una paziente è deceduta per infarto miocardico a un anno dalla guarigione).

L’uso di concentrati piastrinici di seconda generazione e cellule staminali nell’osteomielite da piede diabetico migliorerà la nostra comprensione sulla guarigione delle ferite, in particolare nella terapia rigenerativa delle lesioni cutanee croniche. I risultati ottenuti sui nostri pazienti mostrano che le membrane L-PRF possono essere un nuovo metodo di terapia in questa patologia di difficile trattamento.

Introduzione

L’osteomielite (OM) (infezione ossea) si riferisce specificamente all’infezione del midollo osseo in contrasto con l’osteite, in cui il periostio o la superficie corticale s’infetta attraverso una ferita o un’ulcera penetrante. Nonostante queste differenze, i due sono clinicamente diagnosticati o trattati in modo molto simile. Molto è stato scritto sulla diagnosi di OM nel corso degli anni e, cosa più importante, su cosa complichi le ulcere del piede diabetico (DFU). L’OM che complica il piede diabetico deriva quasi sempre da una ferita contigua o da un’ulcera del piede 1.

Le infezioni alle ossa e alle articolazioni sono dolorose per i pazienti e frustranti per loro e per i loro medici. Gli alti tassi di successo della terapia antimicrobica nella maggior parte delle altre malattie infettive non sono ancora stati raggiunti. I vari tipi di osteomielite richiedono differenti altre strategie terapeutiche mediche e chirurgiche. Questi tipi includono, in ordine decrescente di frequenza: osteomielite secondaria a un focolaio contiguo d’infezione (dopo trauma, intervento chirurgico o inserimento di una protesi articolare); quello secondario all’insufficienza vascolare (nelle infezioni del piede diabetico); o quello di origine ematogena. L’osteomielite cronica è associata alla necrosi avascolare dell’osso e alla formazione del sequestro (osso morto), e il debridement (sbrigliamento) chirurgico è necessario per la cura oltre alla terapia antibiotica. Al contrario, l’osteomielite acuta può rispondere agli antibiotici da soli. In generale, è necessario un approccio multidisciplinare per il successo, che coinvolga le competenze di chirurgia ortopedica, malattie infettive e chirurgia plastica, così come la chirurgia vascolare, in particolare per i casi complessi con perdita dei tessuti molli 2 3.

La fibrina ricca di piastrine (PRF) di Choukroun 4 è un nuovo passo nel concetto terapeutico del gel piastrinico con un design semplificato e piccole modifiche biochimiche artificiali. A differenza di altri concentrati piastrinici, questa tecnica non richiede anticoagulanti, trombina o qualsiasi altro agente gelificante, che rende il sangue non più di un centrifugato naturale senza additivi 5. Sebbene le piastrine e le citochine leucocitarie giochino un ruolo importante nella biologia di questo biomateriale, la matrice fibrinica di supporto costituisce certamente il fattore decisivo del reale potenziale terapeutico del L-PRF. Entro pochi minuti, l’assenza di un anticoagulante consente l’attivazione della maggior parte delle piastrine contenute nel campione per innescare la cascata della coagulazione.

L’utilizzo di concentrati piastrinici di seconda generazione e cellule staminali (PRF e suoi derivati come L-PRF, A-PRF, i-PRF nella DFU con OM non è noto agli Autori fino a oggi.

Casistica clinica

Pazienti

Gli Autori hanno prodotto membrane L-PRF da sangue periferico di 3 pazienti (tutti diabetici) con osteomielite su lesioni cutanee da almeno 6 mesi. Pertanto, è stata analizzata l’evoluzione delle lesioni nel tempo verso la guarigione.

Tutti i pazienti trattati hanno dato il loro consenso informato per l’inclusione prima di partecipare allo studio.

Paziente n° 1: C.D., maschio diabetico di 68 anni per 25 anni; (Body Mass Index) B.M.I. = 35.5; non fumatore; non bevitore alcolico; portatore di oltre 20 anni di ulcera cutanea sul lato interno della gamba sinistra (Fig. 1A-E), penetrando nella struttura della tibia, con lesione ossea (Fig. 1B). Al momento il paziente assume glicazide 60 mg a colazione + sitagliptin fosfato monoidrato/metformina cloridrato 50 mg + 1000 mg a pranzo e a cena; non presenta polineuropatia sensomotoria; glicemia a digiuno ~ 150 mg/DL; Urea 29 mg% (v.n.:10-50); HbA1c DCCT = 6,7% (v.n.: 4-6); HbA1c IFCC = 50 mmol/mol (v.n.: 10-50).

Figura 1A-C-D-E. Caso N° 1. Vari momenti nell’evoluzione della ferita fino alla guarigione, stabile dopo circa 4 anni. B) RMN del paziente con lesione ossea.

Paziente n° 2: D.F.F., femmina diabetica di 71 anni, 40 anni; B.M.I. = 39; ex fumatore; modesto bevitore alcolico; dall’età di 33 anni con ipertensione arteriosa; dall’età di 46 anni presenta cardiopatia ipertensiva con fibrillazione atriale e flutter; all’Ecocolordoppler degli A.I. “Malattia arteriosa ostruttiva”; all’AngioTAC “Femorale comune e superficiale destra stenotiche, asse tibioperoneale dx e sn non evidenziato”; portatore di un’ulcera cutanea del piede destro del 5° dito per circa 1 anno che penetra nella struttura ossea della falange prossimale (Fig. 2A-D). Il paziente prende attualmente 100 mg di ac. acetilsalicilico al giorno, insulina rapida 3 ml 100 U/M (15 U a colazione, 25 U a pranzo, 20 U a cena); insulina lenta 3 ml 100 UI/M (40 U alla sera); presenta anche una grave polineuropatia sensomotoria (classe III); glicemia a digiuno ~ 300 mg/DL; Urea 58 mg% (v.n.: 10-50); HbA1c DCCT = 8,4% (v.n.: 4-6); HbA1c IFCC = 68 mmol/mol (v.n.: 10-50).

Figura 2A-C-D. Caso N° 2. Vari momenti dell’evoluzione della ferita fino alla guarigione, stabile dopo circa 3 anni. B) La lesione dopo l’innesto di L-PRF.

Paziente n° 3: P.C. diabetico femmina di 63 anni dall’età di 39 anni; B.M.I. = 36,3; ex fumatore; non bevitore alcolico; dall’età di 51 anni Insufficienza renale cronica; dall’età di 60 anni presenta fibrillazione e flutter atriale; portatore da circa 3 anni di ulcera plantare del piede destro (Fig. 3A-D), penetrante la struttura ossea del terzo metatarso distale (Fig. 3B). Al momento il paziente assume 100 mg di ac. acetilsalicilico al giorno, insulina rapida 3 ml 100 U/M (3 U a colazione, 6 U a pranzo, 8 U a cena); insulina lenta 3 ml 100 UI/M (14 U alla sera); presenta anche una leggera polineuropatia sensoriale-motoria (classe I); glicemia a digiuno ~ 57 mg/dl (recidiva di ipoglicemia); Urea 112 mg% (v.n.: 10-50); HbA1c DCCT = 7,9% (v.n.: 4-6); HbA1c IFCC = 63 mmol/mol (vn: 10-50).

Figura 3A-C-D). Caso N° 3. Vari momenti dell’evoluzione della ferita fino alla guarigione, stabile dopo sei mesi. La paziente è deceduta dopo un anno e mezzo dall’intervento per altra causa (Ischemia Miocardica). B) RMN con la lesione ossea al 3° raggio metatarsale.

Preparazione del L-PRF

Il sangue è stato raccolto in provette di vetro rivestito in plastica senza anticoagulante né un separatore di gel (provette per siero 9,0 ml), per la produzione di coaguli e membrane L-PRF. Il sangue è stato raccolto rapidamente con un ago nelle provette (22” valore medio, inferiore a 25” per provetta) e immediatamente (entro 1 min) centrifugato secondo la descrizione a una temperatura superiore a 21°C (tra 21 e 30°C) con una Centrifuga DUO secondo il protocollo di Choukroun. Usando la scatola L-PRF, il processo di compressione della membrana nei coaguli viene eseguito attraverso una leggera e omogenea compressione, e la membrana finale rimane sempre omogeneamente bagnata e imbevuta di siero. La tecnica di produzione del PRF è molto semplice e richiede solo un campione di sangue e una centrifuga da tavolo 6-11. Il protocollo è il seguente: i campioni di sangue vengono raccolti in provette da 9 mL, senza anticoagulante o separatore di gel, e vengono immediatamente centrifugati secondo il seguente programma: accelerazione di 30 sec, 2 min a 2700 rpm, 4 min a 2400 rpm, 3 min a 3000 rpm, e 36 sec decelerazione e arresto. Dopo la centrifugazione, tre parti sono localizzate nel tubo: i globuli rossi sul fondo, un coagulo di fibrina che rappresenta il PRF nel mezzo e il plasma acellulare nella parte superiore.

Si estrae il coagulo di fibrina dalla provetta con una pinza sterile ed, eliminando il coagulo rosso dalla sua estremità inferiore, può essere ottenuto il PRF. Il successo di questa tecnica dipende interamente dalla raccolta di sangue e dalla velocità di trasferimento nella centrifuga 6-13. Questo metodo delicato evita l’estrazione e la perdita di una quantità significativa di fattori di crescita. I PRF Box presenti sul mercato sono disponibili in una varietà di forme ed esercitano, attraverso la piastra di compressione, diverse pressioni in base al peso, dando origine a una membrana di spessore, larghezza e lunghezza variabili. La scatola L-PRF 6-13 progettata da noi è costituita da un contenitore metallico 17,5 × 7,6 × 2 cm contenente una piastra di acciaio perforata di 150 × 68 × 1,5 mm. Esiste una seconda piastra in acciaio che funge da compressore, 150 × 68 × 1,5 mm, con un peso di 148 grammi. Questa seconda piastra sagomata esercita una pressione di 142,437 Pa/cm2. In questo studio, la compressione per produrre le membrane è stata esercitata sul coagulo per 2 minuti. Ogni membrana era divisa in tre aree di uguale dimensione: prossimale (testa), centro (corpo) e distale (coda).

È stata utilizzata solo la parte prossimale della membrana 9 10.

Analisi

Sono stati prelevati anche campioni di sangue da ciascun paziente per eseguire un esame emocromocitometrico utilizzando le provette K3E con 5,4 mg di EDTA. In accordo con lo studio di Peck et al. 15, tre campioni di sangue sono stati prelevati dalla vena brachiale sinistra di ciascun paziente attraverso un ago da 18 gauge, due per la produzione di PRF e uno per il conteggio ematico. Gli esami sono stati eseguiti con un contatore di cellule. La valutazione diagnostica dell’OM nei pazienti studiati è stata effettuata prima di tutto attraverso il metodo Probe-to-Bone (PTB) e poi attraverso una risonanza magnetica e una coltura di cellule ossee.

Procedura di innesto di L-PRF

Ciascuno dei tre pazienti dopo una preparazione appropriata (sospensione di almeno 7 giorni di farmaci anticoagulanti e sostituzione con eparina a basso peso molecolare per via sottocutanea) è stato sottoposto a debridement chirurgico, in anestesia sub aracnoidea, in sala operatoria, con rimozione di tessuti non vitali e possibili frammenti ossei sul fondo della lesione, anche per eseguire i test di coltura batterica pianificati. Non sono stati utilizzati farmaci vasodilatatori periferici. Dopo la disinfezione della lesione chirurgica con una miscela al 50% di perossido d’idrogeno e iodopovidone e appropriato controllo dell’emostasi con termocauterio, L-PRF è stato preparato sotto forma di membrane dopo compressione del coagulo per 2 minuti. Il surnatante derivato dalla spremitura è stato raccolto dalla scatola L-PRF con una siringa sterile da 10 cc ed è stato inserito con cura nella lesione cutanea fino all’osso insieme al terzo prossimale della membrana L-PRF (vedi Fig. 2B) 9 10. La medicazione è stata eseguita con garza grassa, garza sterile, cotone germanico e bendaggio elastico adesivo. Il trattamento post-chirurgico è stato con levofloxacina 500 mg cp, 1 cp al giorno per 5 giorni ed eparina a basso peso molecolare (enoxaparina sodica) per 7 giorni. Sulla base dei risultati della coltura e dell’antibiogramma, sono stati aggiunti antibiotici specifici per uso generale per 15 giorni. La prima medicazione è stata eseguita dopo 7 giorni. Per due pazienti (n° 1 e n° 2) è stato necessario eseguire la procedura una seconda volta dopo 40 giorni.

Discussione

Tutti e tre i pazienti hanno eseguito il test “probe to bone” positivo, la RMN ha rilevato ispessimento cortico-periosteale e/o punti focali di osteolisi cortico-spongiosa, con ridotta intensità del segnale nell’adiacenza dell’ulcera cutanea. Anche edema dovuto a infiammazione settica e ascesso di tessuti molli. I batteri sono i patogeni risultati più frequenti, le infezioni fungine sono state trovate nell’OM, ma sono stati descritti protozoi o virus. Nei nostri pazienti sono stati trovati diversi germi allo stesso tempo. Gram-batteri sono stati trovati nel 52% dei casi. Cocchi Gram +, come S. Aureus (15,6%), S. β-emolitico (12,1%), S. Viridans (7,1%) e Bacilli Gram- come Pseudomonas (10,6%), Proteus (7,8%), Enterobacter (5,7%) sono presenti. La Candida è presente nel 2,8%.

L’esame emocromocitometrico non ha mostrato alterazioni importanti. I valori medi rilevati sono: Eritrociti = 4,46 x 106/μl (v.n. = 4-5,2); Leucociti = 7,27 x 103/μl (v.n. = 4,5-11); Hb = 13,5 g/dl (v.n. = 12-16); Hct = 40,2% (v.n. = 32-51); Plt = 235 x 103/μl (v.n. = 130-400); M.C.V. = 91,2 fL (v.n. = 80-100); M.C.H. = 31,9 pg (v.n. = 27-32); M.C.H.C. = 33,6 g/dl (v.n. = 30-37); Neutrofili = 63% (v.n. = 45-65); Linfociti = 25,8% (v.n. = 22-45); Monociti = 8,4% (v.n. = 4-12); Eosinofili = 1,46% (v.n. = 0-7); Basofili = 1,26% (vn = 0-1).

Allo stato, in tutti e tre i pazienti le lesioni cutanee sono guarite (un paziente da quattro anni) senza segni di infezione, né recidive e non sono stati utilizzati mezzi di scarico.

Con la procedura di preparazione del L-PRF, la coagulazione del sangue inizia istantaneamente quando viene a contatto con la superficie del vetro a causa della mancanza di anticoagulante. Se il tempo richiesto per raccogliere il sangue e l’inizio della centrifugazione è estremamente prolungato, la polimerizzazione della fibrina è così diffusa nella provetta e solo una piccola parte del coagulo di sangue sarà ottenuta senza consistenza (PRF-like). Di conseguenza, la raccolta del sangue deve essere seguita da una centrifugazione immediata ed è un prerequisito nelle specifiche dell’output della PRF. È formulato per produrre una membrana spessa omogeneamente idratata e un essudato ricco di piastrine, leucociti, vitronectina e fibronectina espressi in coaguli di fibrina 14-18. Il fibrinogeno è inizialmente concentrato nella parte superiore del tubo, fino all’effetto di formazione della trombina autologa circolante che lo trasforma in una rete di fibrina. Il risultato è un coagulo di fibrina contenente le piastrine situate al centro del tubo, proprio tra lo strato inferiore di globuli rossi e la parte superiore acellulare plasmatica. Il coagulo L-PRF viene quindi posizionato sulla griglia nella scatola L-PRF e coperto con il coperchio compressore. Questo produce una membrana economica di fibrina autologa in circa un minuto. La scatola L-PRF è progettata per la produzione di membrane a spessore costante, che rimangono idratate per diverse ore e consente il recupero dell’essudato sierico espresso da coaguli di fibrina che è ricco di proteine, come la vitronectina e la fibronectina 5. Il coagulo L-PRF è prodotto da un processo di polimerizzazione naturale durante la centrifugazione e la sua architettura fibrinica naturale sembra essere responsabile di un lento rilascio di fattori di crescita e glicoproteine dalla matrice (≥ 7 dd). Le proteine adesive fibrinogeno (Fg), fibronectina (Fn), vitronectina (Vn) e trombospondina-1 (TSP-1) sono abbondanti sulla struttura fibrinosa. Tra i fattori di crescita immagazzinati nelle piastrine e che sono essenziali per la riparazione delle ferite, vi sono PDGF, con -AB e -C; sono anche presenti VEGF-A, TGF- FGF-2; EGF, HGF e fattore di crescita insulino-simile-1 (IGF-1). Analizzando tre citochine proinfiammatorie (IL-1β, IL-6, TNF-α), una citochina infiammatoria (IL-4) e un promotore dell’angiogenesi (VEGF), è stato dimostrato che il PRF potrebbe essere un punto cruciale nella modulazione immunitaria con abilità nel controllo dell’infiammazione.

Conclusioni

Nel complesso, il L-PRF è meccanicamente resistente, in grado di sopportare carichi, ha una capacità di stirarsi due volte sotto tensione e mantiene sufficientemente suture chirurgiche (si deforma in modo significativo prima della lacerazione) 19 20. L’utilizzo del L-PRF nei casi di osteomielite del piede diabetico potrebbe migliorare la nostra comprensione della guarigione delle ferite, in particolare nella terapia rigenerativa delle lesioni cutanee croniche. I risultati ottenuti sui nostri pazienti mostrano che le membrane L-PRF possono essere un nuovo metodo di terapia in questa patologia di trattamento difficile. Inoltre vorremmo eseguire un follow-up annuale per controllare l’evoluzione delle lesioni nei tre pazienti.

Poiché il numero di pazienti trattati con questo metodo è ridotto, intendiamo eseguire uno studio randomizzato per confermare l’effetto clinico di L-PRF, anche valutando la sua azione antibatterica.

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